一、微生物生長控速的目的
微生物發(fā)酵過程中進行控速的目的是多方面的，主要可以歸結(jié)為以下幾點：
1.優(yōu)化生長條件：微生物的生長和代謝受到多種環(huán)境因素的影響，包括溫度、pH值、溶解氧、基質(zhì)濃度等。通過控速，可以調(diào)整和優(yōu)化這些環(huán)境因素，為微生物提供穩(wěn)定的生長條件，從而促進其快速生長和高效代謝。
2.提高產(chǎn)物產(chǎn)量：在發(fā)酵過程中，微生物會合成目標(biāo)產(chǎn)物（如抗生素、酶、有機酸等）。控速可以確保微生物在一定狀態(tài)下進行代謝活動，從而提高產(chǎn)物的合成速率和產(chǎn)量。如果發(fā)酵速度過快，可能會導(dǎo)致底物迅速耗盡，產(chǎn)生抑制微生物生長的副產(chǎn)物，或者使微生物提前進入衰亡期，降低產(chǎn)物產(chǎn)量。
3.保持發(fā)酵穩(wěn)定性：發(fā)酵過程的穩(wěn)定性對于確保產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要。通過控速，可以維持發(fā)酵過程中的各種參數(shù)在穩(wěn)定范圍內(nèi)，避免劇烈波動對微生物生長和代謝產(chǎn)生不利影響。這有助于減少發(fā)酵失敗的風(fēng)險，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。
4.節(jié)約能源和資源：在發(fā)酵過程中，需要消耗大量的能源和資源（如電力、蒸汽、底物等）。通過合理的控速，可以優(yōu)化能源和資源的利用效率，減少浪費和成本。例如，在溶解氧控制方面，通過精確調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，可以確保發(fā)酵液中的溶解氧濃度維持在適宜范圍內(nèi)，避免過度通氣造成的能源浪費和底物氧化損失。
5.應(yīng)對不同發(fā)酵階段的需求：發(fā)酵過程通常包括適應(yīng)期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期等不同階段。每個階段對環(huán)境條件和營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。通過控速，可以根據(jù)不同發(fā)酵階段的需求調(diào)整發(fā)酵條件，確保微生物在每個階段都能獲得穩(wěn)定的生長和代謝環(huán)境。
Tips：耀海生物通過優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基和發(fā)酵控制策略，建立了適用于質(zhì)粒生產(chǎn)的大腸桿菌高密度發(fā)酵平臺工藝，培養(yǎng)周期30h內(nèi)，質(zhì)粒產(chǎn)量超過1g/L。
此外，耀海生物能夠針對不同的質(zhì)粒和宿主菌，基于單因素或DoE方法提供工藝優(yōu)化解決方案，定制化滿足質(zhì)粒高產(chǎn)量、高質(zhì)量需求。
02
二、發(fā)酵過程控速的直接原因
2.1剪切力
由于某些微生物比較脆皮，高轉(zhuǎn)速可能會導(dǎo)致微生物的破裂：
01
細胞破裂：
?高剪切力可能直接導(dǎo)致微生物細胞壁的破裂，釋放出細胞內(nèi)的物質(zhì)。這不僅會影響微生物的存活率，還可能對后續(xù)的發(fā)酵或處理過程產(chǎn)生不利影響。
02
代謝產(chǎn)物泄漏：
?細胞破裂后，細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物會泄漏到環(huán)境中。這些代謝產(chǎn)物可能具有生物活性或毒性，對環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。
03
發(fā)酵效率降低：
?如果大量微生物細胞在發(fā)酵過程中破裂，會導(dǎo)致發(fā)酵液中細胞濃度的降低，從而影響發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。
2.2氧中毒
對于好氧微生物來說，氧中毒的機理主要涉及氧自由基的過量生成與損害以及抗氧化防御系統(tǒng)的失衡。在高氧濃度或壓力下，好氧微生物可能面臨氧化應(yīng)激的風(fēng)險，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞以及細胞死亡。因此，在培養(yǎng)和應(yīng)用好氧微生物時，需要控制適當(dāng)?shù)难鯕鉂舛群蛪毫l件，以確保其正常生長和代謝活動。因此需要通過限制通氣比進行控速發(fā)酵。
a.在高通氣狀態(tài)下：如果微生物所處的環(huán)境中氧氣濃度過高，可能會對其造成損害，甚至導(dǎo)致死亡。這種損害機制可能與氧自由基的生成和攻擊有關(guān)。
b.控制通氣量：在發(fā)酵過程中，應(yīng)根據(jù)微生物的需求和耐受性合理控制通氣量，避免過高或過低的氧氣濃度。
c.監(jiān)測氧濃度：定期監(jiān)測發(fā)酵液中的氧濃度，確保其在適宜的范圍內(nèi)。
d.優(yōu)化發(fā)酵條件：除了通氣量外，還應(yīng)關(guān)注其他發(fā)酵條件如溫度、pH值、底物濃度等，以創(chuàng)造適合微生物生長和產(chǎn)物合成的環(huán)境。
e.加強設(shè)備維護：確保發(fā)酵設(shè)備處于良好狀態(tài)，避免設(shè)備故障導(dǎo)致通氣量異常。
2.3底物抑制
高濃度底物會抑制微生物代謝，主要是因為以下幾個方面：
1. 底物濃度的增加會導(dǎo)致溶液的滲透壓升高，從而影響微生物的生長和繁殖。高濃度的底物會抑制微生物的生長和繁殖，因為過高的滲透壓會破壞細胞膜，導(dǎo)致細胞失水或過度吸水，從而對細胞的正常功能產(chǎn)生影響。
2. 高濃度的底物可能會導(dǎo)致代謝途徑的飽和。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_到一定水平時，相應(yīng)的酶可能會達到飽和狀態(tài)，從而導(dǎo)致底物濃度進一步增加時，反應(yīng)速度不再增加。
3. 高濃度的底物還可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝 overflow現(xiàn)象。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，微生物可能會啟動不必要的代謝路徑，導(dǎo)致能量浪費和副產(chǎn)物的生成，這也會影響目標(biāo)產(chǎn)物的的學(xué)習(xí)。
在微生物代謝研究中，控制底物濃度對于調(diào)節(jié)代謝途徑、提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和效率具有重要意義。
2.4產(chǎn)物抑制
產(chǎn)物濃度過高會顯著抑制微生物的生長與代謝，減緩發(fā)酵速率，甚至導(dǎo)致發(fā)酵失敗。高濃度產(chǎn)物可能直接毒害細胞，影響酶活性和代謝途徑，同時增加發(fā)酵液滲透壓，破壞細胞平衡。因此，控制發(fā)酵速率至關(guān)重要，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件、添加抑制劑等手段，維持適宜的產(chǎn)物生成速度，防止過度積累。同時，提升產(chǎn)物分離速率，實現(xiàn)邊發(fā)酵邊分離的耦合工藝，能有效降低產(chǎn)物濃度，減輕抑制作用，保障發(fā)酵過程穩(wěn)定進行，提高產(chǎn)物產(chǎn)量與品質(zhì)。解決方案以耦合發(fā)酵或灌流培養(yǎng)為主。
耦合發(fā)酵工藝，即邊發(fā)酵邊分離的技術(shù)，是一種將發(fā)酵過程與產(chǎn)物分離過程緊密結(jié)合的先進工藝。它通過在發(fā)酵過程中采用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)，如膜分離、萃取等，實時將產(chǎn)物從發(fā)酵液中分離出來，從而有效降低產(chǎn)物濃度，解除對微生物的抑制作用，提高發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。這種工藝不僅優(yōu)化了發(fā)酵過程，還提高了產(chǎn)品的純度和回收率，是現(xiàn)代生物發(fā)酵工業(yè)的重要發(fā)展方向。
2.5畸形合成
a.mRNA穩(wěn)定性下降：在快速生長的條件下，細胞內(nèi)的mRNA穩(wěn)定性可能會受到影響，導(dǎo)致與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的mRNA降解速度加快。這將減少可用于翻譯的mRNA數(shù)量，進而影響蛋白質(zhì)的合成。
b.核糖體功能受損：雖然核糖體本身不會因生長速率過快而直接減少，但快速生長可能導(dǎo)致的代謝壓力增加和資源分配不均等問題可能間接影響核糖體的功能。例如，核糖體可能無法獲得足夠的能量或氨基酸來支持高效的蛋白質(zhì)合成。
c.蛋白質(zhì)折疊和修飾異常：由于缺乏高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在快速生長的細胞可能無法為新生蛋白質(zhì)提供足夠的折疊和修飾環(huán)境。這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法正確折疊成具有生物活性的構(gòu)象，或者無法獲得必要的糖基化、磷酸化等修飾，從而影響其功能和穩(wěn)定性。
由于以上所述原因，對于原核類微生物來說通過調(diào)整培養(yǎng)基成分、補料策略、溫度等方式來控制微生物的生長速率，有助于保持細胞內(nèi)的代謝平衡和基因表達調(diào)控的穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的合成效率和質(zhì)量。
2.6能量分配與物質(zhì)分配
在微生物工藝中，控速發(fā)酵是確保各階段平衡的關(guān)鍵。通過精細調(diào)控發(fā)酵速率，可以優(yōu)化時間、生物量、營養(yǎng)和能源的分配。通過分段工藝設(shè)計，綜合考慮微生物生長周期，維持適宜的生長條件，避免過快或過慢導(dǎo)致資源浪費或產(chǎn)物抑制。控速發(fā)酵旨在實現(xiàn)資源較大化利用，提高產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量，是現(xiàn)代生物發(fā)酵工業(yè)的重要策略。
03
三、控速策略
微生物發(fā)酵控速的邏輯很大程度上是圍繞控制微生物體內(nèi)酶催化反應(yīng)的速率來展開的。酶是生物體內(nèi)催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它們能夠加速反應(yīng)進程而不改變反應(yīng)的總能量變化。在微生物發(fā)酵過程中，酶催化反應(yīng)的速率直接影響著代謝產(chǎn)物的生成速度和發(fā)酵效率。快速且穩(wěn)定的酶催化反應(yīng)速率有助于提高發(fā)酵效率，減少發(fā)酵時間，并可能提高產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量。
3.1溫度控制
酶的活性受溫度影響顯著。一般來說，每種酶都有其適溫度范圍，在此范圍內(nèi)酶活性高，反應(yīng)速率快。因此，通過控制發(fā)酵溫度，可以調(diào)控酶催化反應(yīng)的速率。
例如，對于某些需要高溫發(fā)酵的微生物，可以提供適宜的高溫環(huán)境來加速酶催化反應(yīng)；而對于需要低溫發(fā)酵的微生物，則需要保持較低的溫度以維持酶的活性。
3.2pH值調(diào)控
酶的活性也受pH值的影響。每種酶都有其較適pH值范圍，偏離此范圍酶活性會下降甚至失活。因此，通過調(diào)控發(fā)酵液的pH值，可以影響酶催化反應(yīng)的速率。可以定期檢測發(fā)酵液的pH值，并根據(jù)需要添加酸堿調(diào)節(jié)劑來保持較適發(fā)酵狀態(tài)。
3.3底物濃度與營養(yǎng)條件
底物濃度是影響酶催化反應(yīng)速率的重要因素之一。底物濃度過高可能導(dǎo)致底物抑制效應(yīng)，降低反應(yīng)速率；而底物濃度過低則可能限制反應(yīng)速度。因此，需要控制底物的投加量和投加速度，以維持適宜的底物濃度范圍。
此外，微生物在發(fā)酵過程中還需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)來維持其生長和代謝活動。提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)有助于提高酶催化反應(yīng)的速率和效率。
3.3溶氧量與通氣量
對于好氧微生物來說，溶氧量是影響其代謝活動的重要因素之一。通過控制通氣量和攪拌速度等參數(shù)，可以調(diào)控發(fā)酵液中的溶氧量水平，從而影響酶催化反應(yīng)的速率。一般來說，在好氧發(fā)酵過程中需要保持較高的溶氧量水平以促進微生物的生長和代謝活動；而在厭氧發(fā)酵過程中則需要保持較低的溶氧量水平以避免氧氣對厭氧微生物的抑制作用。
3.4發(fā)酵時間的累積控制
發(fā)酵時間也是影響酶催化反應(yīng)速率和產(chǎn)物生成量的重要因素之一。通過控制發(fā)酵時間的長短可以調(diào)控微生物的代謝活動和產(chǎn)物的生成量。在實際操作中需要根據(jù)具體的發(fā)酵工藝和產(chǎn)物需求來確定合適的發(fā)酵時間范圍。
04
四、哪些類型的發(fā)酵需要控速
4.1高耗氧菌株
高耗氧菌株指那些在生長和代謝過程中需要大量氧氣的微生物種類。這些菌株在消耗氧氣方面效率較高，常見于各種基因工程菌，在生物降解、污水處理等需高氧環(huán)境的工業(yè)應(yīng)用中。例如，枯草芽孢桿菌作為一種典型的高耗氧菌株，在廢水處理中能夠迅速消耗大量氧氣，有效分解有機污染物，顯著降低水體化學(xué)需氧量。其高效的耗氧能力使其成為環(huán)保領(lǐng)域的重要微生物資源。
4.2剪切力敏感菌株
對剪切力敏感的微生物主要包括但不限于以下幾類：
a.植物細胞，植物細胞由于其細胞壁僵硬脆弱且胞內(nèi)存在較大的液泡，對剪切力相對敏感。適當(dāng)?shù)募羟辛梢源龠M細胞生長和增強代謝，但過大的剪切力會對細胞造成機械性損傷，降低細胞活性或破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，從而影響細胞生長代謝。具體例子：如紅花細胞（Carthamus tinctorius L.），其耐受剪切力的閾值較低，當(dāng)剪切力超過一定范圍時，會影響細胞的生長和代謝。
b.乳動物細胞，哺乳動物細胞沒有細胞壁，其細胞膜相對較為脆弱，容易受到外界機械力的影響。此外，哺乳動物細胞通常具有較大的尺寸，這使得它們更容易受到剪切力的影響。
c.檸檬酸發(fā)酵中的黑曲霉：檸檬酸黑曲霉作為檸檬酸發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌，是一種剪切力敏感型微生物。其形態(tài)學(xué)特征會顯著影響檸檬酸的產(chǎn)量。在檸檬酸發(fā)酵過程中，過大的剪切力可能會影響黑曲霉的生長和代謝，從而影響檸檬酸的產(chǎn)量。
d.不同生長階段的細胞：植物細胞在不同生長時期對剪切的響應(yīng)也不同。例如，處于對數(shù)期的紅豆杉細胞對剪切力敏感。
剪切力對微生物的影響是一個復(fù)雜的過程，不僅與微生物的種類和生長階段有關(guān)，還與剪切力的強度、持續(xù)時間以及環(huán)境條件等多種因素有關(guān)。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況對剪切力進行控制和優(yōu)化，以確保微生物的生長和代謝處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
4.3原核類微生物
原核微生物則沒有成形的細胞核，也缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，這限制了它們在蛋白質(zhì)翻譯后修飾和分泌方面的能力和速度。因此表達過程控速進行。
4.4分段控制類發(fā)酵工藝
補料類工藝、溫敏類菌株、誘導(dǎo)類工藝、混菌類發(fā)酵、氧切換發(fā)酵、底物切換類發(fā)酵等都需要進行分段工藝設(shè)計，分段工藝在某些時期進行控速調(diào)節(jié)。
05
五、控速階段選擇
5.1全程控速
如某些酒類的發(fā)酵過程追求低溫長時發(fā)酵，由于發(fā)酵速度較慢，微生物有足夠的時間來分解和利用原料中的成分，從而產(chǎn)生更多的風(fēng)味和香氣物質(zhì)。這些物質(zhì)能夠賦予發(fā)酵制品獨特的風(fēng)味和香氣，使得產(chǎn)品更加具有吸引力和競爭力。例如，在釀酒過程中，低溫緩慢發(fā)酵有利于醇甜物質(zhì)和酯類物質(zhì)的形成，使得酒質(zhì)更加醇厚、香氣更加濃郁。
5.2生長期控速
生產(chǎn)大罐時期，對于生長偶聯(lián)類微生物發(fā)酵有可能需要全程控速，將生長曲線的生長期做長，使得微生物更多的時間處于生長期，從而增加表達時間。
5.3種子期控速
生長過快會導(dǎo)致老化，有的時候也需要通過調(diào)整理化參數(shù)適配接種時間點等。
